מחלות גנטיות הן עדיין אתגר עולמי, שכן הן נגרמות ממוטציות בגנים המשפיעות על התפקודים הביולוגיים, תהליכים מטבוליים או ייצור של חלבונים חיוניים מסוימים של אנשים, להפרעות תורשתיות שונות. תרופות לטיפול גנטי הן סוג של התערבות טיפולית המכוונת לגנים ספציפיים, במטרה לתקן או לשנות אותם, ולספק הנחיות חדשות לתאים לייצר חלבונים פונקציונליים או להתערב בפגמים בגנים הגורמים למחלות.
תרופות הגנים הנפוצות כוללות בעיקר DNA ו-RNA, כאשר ה-DNA יכול להיות שברי גנים או רצפי גנים בעלי השפעות טיפוליות. DNA אלה מועברים לתאים כדי להחליף או להשלים את תפקודי הגנים הפגומים או החסרים. RNA יכול להיות RNA שליח (mRNA), RNA מפריע קטן (siRNA), או אוליגונוקלאוטידים אנטי-חושים (ASO) וכו', שיכולים לשמש כדי לשנות, לעכב את הביטוי של גנים מזיקים, או לשחזר את התפקוד של גנים ספציפיים.
עם זאת, גם DNA וגם RNA מתמודדים עם אתגרים רבים החל מכניסה לגוף האדם ועד הגעה לתאי המטרה. מכיוון שרצפי הגנים אינם יציבים במערכת העיכול, הם ניתנים בדרך כלל בהזרקה תוך ורידית או תת עורית, אך למרות זאת, רוב רצפי הגנים עדיין מתפוררים על ידי הגרעינים השופעים בגוף האדם.
כאשר כמות קטנה של תרופות גנים שיוריות מגיעה לחלק החיצוני של תאי המטרה, הן אינן יכולות להיכנס לתאים מכיוון שרצפי הגנים הם מולקולות גדולות עם קבוצות פוספט הנושאות מטענים שליליים, בעוד שקרום התא נושאות גם מטענים שליליים. כאשר שני מטענים שליליים נפגשים, גנים נדחים ואינם יכולים להיכנס לתאים. לכן, עלינו לפתח שיטות ספציפיות לאספקת תרופות גנים כדי למנוע את הפירוק שלהן in vivo ולשפר את היעילות של חדירת ממברנות התא, ולספק רצפי DNA או RNA לתאים בצורה חלקה.
שיטות מסירה של תרופות גנטיות
שיטות מסירת הגנים הנפוצות כיום מחולקות בעיקר לשתי קטגוריות: מסירה וקטורית ויראלית ומסירת וקטור לא-ויראלית. מסירה וקטורית ויראלית כוללת בעיקר נגיפים הקשורים לאדנו-(AAV) ולנטיוירוס וכו', שיכולים לדמות תהליך של הדבקה בנגיף של תאי מארח ולעבור בקלות מחסומי תאים, ובכך להשיג יעילות מסירה גבוהה. עם זאת, למשלוח וקטור ויראלי יש גם בעיות: ראשית, יש לו יכולת אריזה מוגבלת, כגון קיבולת האריזה המקסימלית של AAV היא 4.7kb, שאינה יכולה לספק רצפי גנים ארוכים יותר; שנית, וקטורים ויראליים עלולים לגרום לתגובות חיסוניות רציניות, כולל חסינות תאית וחסינות הומורלית, מהווים סיכונים ליישומים קליניים. בהשוואה לזה, לוקטורים לא-ויראליים יש יתרונות עצומים בבטיחות וביכולת טעינת תרופות.
הווקטורים הלא{0}}ויראליים הנפוצים כיום כוללים בעיקר ליפוזומים, פולימרים, ננו-חלקיקים, אקסוזומים וכו', ביניהם הליפוזומים הם שלפוחיות שנוצרו על ידי מולקולות אמפיפיליות בקטרים הנעים בין 100 ננומטר ל-1um. הם מורכבים בעיקר מפוספוליפידים, כולסטרול, שומני PEG ושומנים קטיוניים. מבנה דו-שכבת הפוספוליפיד דומה לממברנות התא ויכול להיכנס לתאים בצורה חלקה באמצעות אנדוציטוזיס. בנוסף, ליפוזומים יכולים גם לשנות PEG או נוגדנים ספציפיים על פני השטח שלהם כדי לחמוק מהפינוי החיסוני של הגוף תוך מיקוד לרקמות או תאים ספציפיים. ליפוזומים קטיוניים הם ליפוזומים המכילים שומני מלח אמוניום רבעוניים בעלי מטען חיובי, שיכולים להיקשר טוב יותר עם תרופות חומצת גרעין טעונות שלילי ולשמור על יציבות מערכת הלידה. לכן, ליפוזומים הם אחת מהשיטות הנפוצות לא-להעברת וקטורים ויראליים לתרופות גנים.
עם זאת, לליפוזומים מסורתיים יש גם כמה בעיות: קודם כל, בשל הטווח הגדול של קוטרי הליפוזומים, למרות שזה יכול להבטיח יכולת העמסת תרופות מספקת, כאשר ליפוזומים עוברים דרך מרווח האנדותל של כלי הדם (100-200nm), גודל גדול מדי יעכב תהליך זה. בנוסף, לאחר שליפוזומים נכנסים לתאים דרך אנדוציטוזה ויוצרים מערכת אנדוזום-ליזוזומים, ליפוזומים מסורתיים אינם יכולים להשלים בריחה הליזוזומלית בזמן, וכתוצאה מכך רוב תרופות הגנים מתפוררות על ידי הליזוזומים ואינן מסוגלות להפעיל את השפעותיהן. בהתבסס על חסרונות אלו של ליפוזומים מסורתיים באספקת תרופות גנים, פותחו ננו-חלקיקי שומנים (LNP) והפכו לשיטת מסירה חשובה המתאימה במיוחד לאספקת חומצות גרעין לתאי מטרה ולרקמות.
מבוא למערכת הספקים של LNP
ננו-חלקיקים ליפידים (LNP) הם ננו-חלקיקים המורכבים מחומרים דמויי שומנים- ובקוטר בדרך כלל בין 10-200 ננומטר. בהשוואה לליפוזומים מסורתיים, הם קטנים יותר וקלים יותר לעבור אותם דרך פערי אנדותל כלי דם. בנוסף, LNP מורכב בדרך כלל משומנים קטיוניים/מייננים, פוספוליפידים עזר, שומני פוליאתילן גליקול (PEG) וכולסטרול. ביניהם, פוספוליפידים עזר וכולסטרול יכולים להגביר את היציבות של LNP; שומני PEG עוזרים להגביר את זמן מחזור הדם של LNP in vivo ולהפחית את התגובות החיסוניות. לרכיבים אלה יש פונקציות דומות לליפוזומים מסורתיים. ההבדל טמון בליפידים הקטיוניים/הניתנים למינון, שהם גם התחום העיקרי של הגנת הפטנט על LNP.
כפי שהוזכר קודם לכן, ליפוזומים קטיוניים יכולים לשמור ביעילות על הקישור עם תרופות חומצות גרעין ולשפר את יעילות האספקה של תרופות חומצות גרעין. עם זאת, ליפוזומים קטיוניים נוטים גם לקישור לא-ספציפי עם חלבוני פלזמה טעונים שליליים, תאי דם וכו' במחזור הגוף, מה שגורם להצטברות ליפוזומים ולפינוי מהיר אל מחוץ לגוף (מחצית החיים של ליפוזומים קטיוניים in vivo הוא 15 דקות בלבד).
כדי לפתור בעיה זו, חוקרים פיתחו סוג חדש של חומר שומני הנקרא שומנים מייננים. שומנים מייננים דומים מאוד לליפידים קטיוניים במבנה. אם ניקח לדוגמא את הליפיד הקטיוני הנפוץ DOTAP ואת הליפיד המיונן DODAP, ההבדל הוא ש-DOTAP הוא מלח אמוניום רבעוני עם מטען חיובי, בעוד ש-DODAP הוא מבנה אמין שלישוני. מבנה האמין השלישוני יכול לשמור על ה-pKa של השומנים בין 6-7. כאשר ה-pH נמוך מ-pKa (בתנאים חומציים), שומנים מייננים טעונים חיובית.
כאשר ה-pH קרוב ל-pKa (בתנאים ניטרליים), השומנים הניתנים למינון הם ניטרליים. עיצוב זה יכול לפתור בחוכמה את הבעיה בה נתקלים ליפוזומים קטיוניים: מכיוון שה-pH במחזור הדם קרוב לנייטרלי, שומנים מייננים הם גם ניטרליים, והקישור הלא-ספציפי בינם לבין חלבוני פלזמה או תאי דם מופחת משמעותית, מה שמאריך את מחצית החיים. בנוסף, כאשר LNP ליפיד מייננן נקלט על ידי תאים ונכנס לליזוזומים, הליפידים מיוננים וטעונים חיובית בסביבה הליזוזומלית עם pH 5-6. הליפידים הטעונים בחיוב מתמזגים בקלות עם קרום האנדוזום-ליזוזום, ומאפשרים לליפוזומים לברוח לציטופלזמה, להתנתק ולשחרר חומצות גרעין, ובכך להפעיל את השפעותיהם. לסיכום, תכנון מערכת נשא LNP כרוכה באופטימיזציה של הרכב השומנים, גודל החלקיקים, מטען פני השטח ויציבות כדי להשיג מסירת גנים יעילה.
אסטרטגיית ביואנליזה של LCMS עבור תרופות גנים ארוזות-LNP
תרופות גנים ארוזות -LNP מורכבות בעיקר ממעטפת LNP ומתרופה גנטית עצמה. מעטפת ה-LNP מורכבת בעיקר ממרכיבי שומנים (ליפידים קטיוניים/ניתנים למינון מהווים כ-30-50%, שומני PEG מהווים כ-2%, כולסטרול מהווה כ-20-50%, פוספוליפידים עזר מהווים כ-10-20%), בעוד שתרופות גנים מורכבות בעיקר משברי גנים, ASO, DNA וכו'. על פי התקנות העדכניות ביותר של NMPA ו-FDA[14-15], עבור יישום IND של תרופות למערכת מתן תרופות כגון LNP, בנוסף לביצוע מחקרים פרמקולוגיים ופרמקוקינטיים על החומר הפעיל (רצף הגנים), נדרשות בטיחות והערכה תרופתית גם עבור רכיבי שומנים חדשים שלא שימשו בתרופות משווקות במערכת מתן תרופות/לפידים מיוחדים של PEG ו-PEG lipids. ב-LNP.
הביואנליזה של LCMS של שומני LNP מתמקדת בשומנים קטיוניים/ניתנים ליוניזון ובשומני PEG. בשל ההבדלים המבניים ביניהם, משקל מולקולרי שומנים קטיוני/מיינן הוא בדרך כלל בטווח של 1 kDa, בעוד משקל מולקולרי שומני PEG יכול להגיע ל-2~5 kDa לאחר נשיאת קבוצות שינוי, וכתוצאה מכך הבדלים גדולים בשמירה כרומטוגרפית ותגובת ספקטרומטריית מסה ביניהם. בהתחשב בכך שתכולת השומנים הקטיוניים/הניתנים ליוניזם ב-LNP גבוהה מזו של שומני PEG, ההבדל בתגובה מוביל לחוסר היכולת לאחד ביעילות את שיטות הטיפול המקדים (בחירת ממס מיצוי, קביעת גורם הדילול) של שניהם. בנוסף, בשל נוכחותם של פסגות מפריעות רבות סביב מיקום השיא של שומני PEG, נדרשת לעיתים קרובות שיפוע הפרדת פאזה נוזלית ארוכה יותר להפרדה יעילה, שאינה יכולה להבטיח יעילות אנליזה גבוהה. לכן, אנו מקימים בנפרד את שיטת זיהוי השומנים PEG בביואנליזה. יחד עם זאת, לליפיד קטיוני/מיינן ולפיד PEG יש גם קשיים נפוצים בפיתוח השיטה בשל מרכיבי השומנים שלהם, כגון מסיסות ירודה במים, חוסר יציבות במטריקס ביולוגי, קשירת חלבון להחלמה מעבר לגבול, הפרעות גבוהות ושאריות של שומני PEG, שינוי יציבות של שומנים במטריקס אמיתי של דגימה וקושי בבחירת תקן פנימי.
